浙江大榭检验检疫局攻克汉坦病毒检测难题

　　浙江宁波大榭检验检疫局公共卫生实验室从样本制备到得出检测结果，与原来使用特异性套式分型引物鉴定方法相比，CODEHOP RT-PCR检测技术大幅度缩短了检测时间，总耗时不到4小时，并且具有操作简便、特异性强，灵敏度高的特点，填补了国内外空白，达到了国际领先水平。

　　病毒流行 急需技术防控

　　据了解，汉坦病毒可引起肾综合征出血热和汉坦病毒性肺综合征，前者临床上以发热、出血、肾脏损害为主，国内较常见；而后者主要临床表现为，在4日左右的发热、头痛等前驱期症状后，出现以非心源性肺水肿和高病死率（52.4%~78.0%）为特征的急性呼吸衰竭，重症3日～7日死亡，主要流行于美国，在阿根廷、巴西等国也发现过病例，国内尚未发现，但有发生的可能。

　　研究表明，在自然界中存在较多型别的汉坦病毒，且不同型的致病性也不一样。目前，汉坦病毒遍及亚洲、欧洲、非洲、美洲、大洋洲等70多个国家，其流行之广，危害之重，已成为全球性的公共卫生问题。

　　在国内，汉坦病毒的感染情况尤为严重，每年感染汉坦病毒导致发病的人数占世界报道病例数的90％以上，近10年来我国年报告发病人数一直高达4万～6万人，而且新疫区不断出现。同时，还陆续发现了新型别的汉坦病毒，如哈巴罗夫斯克病毒、阿穆尔病毒、索托帕拉雅病毒等。

　　汉坦病毒不仅感染人，而且被许多啮齿类动物特别是食虫目动物长期携带，更严峻的是，这些作为传染源的宿主动物范围仍在持续扩大，而且一种宿主动物还可能同时携带不同型别的汉坦病毒，这对该病毒的检测防控提出了更大的挑战。

　　因此，不断拓展对该病毒的研究、完善技术防控体系成为了一项重大课题。大榭检验检疫局公共卫生实验室围绕关键技术、疑难问题，经过1年多的科研攻关，研制出了“汉坦病毒群的简并RT-PCR”检测技术。2012年5月，该技术的相关科研课题《鼠类携带未知病毒简并PCR检测方法建立与应用》顺利获得国家质检总局立项，大大提升了大榭检验检疫局的技术支撑力量。

　　眼光独到 创新检测方法

　　创新是科学的生命力。科研攻关前期，经过深入研究分析，大榭检验检疫局研究团队清楚地认识到，现有汉坦病毒的基因学检测方法主要针对特定型别的汉坦病毒进行检测，但是由于汉坦病毒群型别众多，同时具有快速进化变异的特点，一些新型的汉坦病毒不断出现，迫切需要建立能够对未知型汉坦病毒的检测方法。

　　此外，该团队还考虑到，针对这些病原体，分离培养、直接或间接荧光抗体检测、免疫组化染色、酶联免疫反应等传统检测方式，都需要较高的实验室设备和条件，相对而言核酸检测技术的设备条件要求较低，并且具有特异性强、灵敏度高、快速便捷等特点。

　　因此，研究团队以独到的眼光，首创应用CODEHOP-PCR方法检测汉坦病毒属内各类病毒。CODEHOP技术，是一种新型的简并引物的设计方法，兼有简并性和特异性的特点，能够在保证PCR扩增特异性的同时，可以扩增编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。而PCR是上世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。CODEHOP-PCR方法检测取两者之长，能够方便、快速地扩增鉴别新的物种和亲缘性较远的序列，当怀疑一种未知病原体为某病毒或细菌家族的成员，或一个未知基因是某基因家族成员时，可以进行有效验证，也可以用于某病毒家族成员内新病毒的检测和发现，很好地解决了常规PCR引物只能扩增特定某种病原体或亲缘关系较近病原体的问题。

　　以能够检测汉坦病毒属内已知和未知的病毒为目标，大榭检验检疫局研究团队充分发挥CODEHOP-PCR方法检测的优势，设计筛选了一对简并引物，对RT-PCR反应体系进行了优化，提高了检测的灵敏度、特异性，可以检测国内流行的流行性出血热病毒中的汉城型病毒、汉坦型病毒，同时也可以检测市面上试剂盒所不能检测的其他型汉坦病毒，为该病毒的防控提供了一道坚实的技术屏障。

　　应用广泛 立足工作实际

　　“我们开展的课题就是要从日常的口岸媒介携带病原体检测工作实际出发，将检测变得更快、更准确，同时又能检测更多的病原体。”该团队负责人、高级工程师胡群如是说。

　　自建立CODEHOP RT-PCR检测技术以后，就被应用于大榭口岸日常检获的鼠类样品携带汉坦病毒的检测。2012年，大榭检验检疫局研究团队利用该方法，在输入性鼠类样品中检测出汉坦病毒阳性，属于浙江省首例，此外，在口岸日常监测的鼠类样品中还检测到了2例汉坦病毒阳性。

　　此外，在该项技术的基础上，研究团队还研制出了检测试剂盒。今年7月31日，该试剂盒顺利通过了国家技术发明专利授权。通过该试剂盒，研究团队对实验室分离保存的汉坦型、汉城型两个汉坦病毒样本以及其他型别的病毒基因进行了测试，均能得到预期效果。

　　这些应用结果充分表明，大榭检验检疫局公共卫生实验室创建的CODEHOP RT-PCR方法非常适用于口岸鼠类携带汉坦病毒的快速检测，具有广泛的推广前景。