浙江宁波检验检疫局DNA技术鉴定检疫性真菌获突破

　　由浙江宁波检验检疫局主持的国家质检总局科技项目“基于DNA条形码的两种检疫性轮枝菌快速识别技术研究”通过鉴定。鉴定委员会认为，该研究在大丽轮枝菌、黑白轮枝菌ITS条形码研究方面取得了明显的创新性成果，达到同类研究国际先进水平。

　　该项目针对两种检疫性轮枝菌传统形态特征鉴定难的问题，通过DNA条形码技术，采用生物学性状结合rDNA-ITS序列分析将两种检疫性轮枝菌从其他植物病原性轮枝菌中区分出来。综合评价了COI、ITS、28S、18S、VTUB、VEF、MAPK片段作为轮枝菌属DNA条形码的可行性，得出ITS作为轮枝菌属DNA条形码效果最佳，建立了有效区别大丽轮枝菌、黑白轮枝菌和其他近似种的实时荧光PCR快速检测方法。

　　检疫性真菌鉴定难

　　检疫性真菌是一类危害严重的有害生物，其检测与控制一直以来是植物有害生物研究中的难点、热点问题。

　　与杂草、昆虫等检疫对象不同，检疫性真菌具有个体微小、菌种采集、分离和保藏困难、难以简单依靠形态特征进行划分等特点。2007年发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》列出了124种植物病原真菌作为我国重要植物检疫对象，2009年农业部组织制定的《全国农业植物检疫性有害生物名单》列出了6种真菌作为内检对象。由于这些真菌种类涉及分类跨度巨大，形态千变万化，在实际工作中检测方法难以统一，存在一定主观性，即使能够依据真菌形态对其进行鉴定，对鉴定人员专业素质也具有非常高的要求。

　　其中，隶属于半知菌轮枝菌属的大丽轮枝菌和黑白轮枝菌具有很强代表性。大丽轮枝菌和黑白轮枝菌属于我国重要植物检疫对象，能长时间在土壤中存活，引起植物维管束病害，造成作物减产，甚至绝产。传统上鉴定这两种轮枝菌种类的主要依据是微菌核和休眠菌丝有无等形态特征。但是，不同轮枝菌常因环境条件的影响而发生变异，其形态变异主要表现为菌落形态的改变和微菌核的丧失，这给检疫性轮枝菌种类的鉴定带来了极大困难。

　　面临三大技术难题

　　真菌DNA条形码研究一直受到分子标记筛选工作的限制，本研究的关键问题之一是如何选择获得有效分子标记，只有做到这一点，才能建立相关的DNA条形码系统。在广泛调研国内外文献和预实验的基础上，选择了ITS、β-tublin、EF、MAPK、COI、LSU、SSU序列片段作为备选分子标记。这些片段包括了目前真菌上所使用的主要条形码备选片段，研究结果将有较强系统性。

　　该研究的另一关键问题是如何评价DNA条形码标记。通过大量菌株的PCR扩增、片段纯化、测序或克隆测序，全面获取这些片段可用于条形码的序列特征，在此基础上对这些序列进行同源性分析和序列比对工作，应用条形码最新研究成果，采用多个条形码评价软件对其进行筛选和评价，最终发现，评价指标受所选择分子标记片段长短、结构等因素影响，通过PCR扩增成功率、序列变异（种内外）和鉴定成功率的比较和评价来考察备选DNA条形码的适用性。研究过程中引用消化吸收了条形码研究目前最为先进的筛选评价体系，该体系对于其他条形码研究具有很强示范性。

　　解决了前面的问题，新的问题也是最重要的问题摆在了研究人员面前，如何有效地利用DNA条形码技术进行检测。在获得轮枝菌属种间群体中多个分子标记片段后，通过对序列的比较和分析，应用Real time PCR技术建立了检疫性轮枝菌标准化快速检测鉴定技术。

　　未来应用范围广阔

　　检疫性真菌种类多，形态千变万化，对鉴定人员专业素质有非常高的要求。为解决检疫性真菌鉴定难的难题，宁波局主持的“基于DNA条形码的两种检疫性轮枝菌快速识别技术研究”，重点研究开发了7个有望应用于真菌DNA条形码的片段，并对这些片段进行了全面的筛选和评价以及应用工作，在DNA条形码研究的基础上，不仅建立了有效区别大丽轮枝菌、黑白轮枝菌和其他近似种的实时荧光PCR快速检测方法，并且利用项目研发的技术，宁波口岸在全国首次截获葡萄茎枯病菌和可可花瘿病菌，国家质检总局据此发布警示通报2次。该项目开展的检疫性真菌标准化有效识别研究，对于控制其危害，及时阻断其传播、扩散，起着至关重要的作用，同时对于其他检疫性有害生物也具有重大示范作用和实际意义。

　　标准化是未来口岸检验检疫发展的必然趋势，DNA条形码技术正是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段而创建的一种新的生物身份识别系统，以实现对物种的快速自动鉴定。随着以凭证标本为主的DNA参考序列数据库的建立，也将极大地提高生物样本的分析效率并且有助于提高口岸疫情检测能力。

　　2012年，宁波局从进境台湾芹菜组织中分离到一株轮枝菌属菌株，经形态学观察和利用筛选获得轮枝菌条形码片段将该分离物鉴定为变黑轮枝菌（Verticillium nigrescens）。变黑轮枝菌在我国分布、报道有限，这是首次从我国台湾进境旅客携带物芹菜中检出变黑轮枝菌。2012年，宁波局从来自意大利的进境观赏苹果种苗叶片上，通过PDA分离培养获得1株疑似葡萄茎枯病菌的菌株ZM40-1，采用DNA条形码技术分离获得的菌株被鉴定为葡萄茎枯病菌（Phoma glomerata），该有害生物经中国检科院确认为全国口岸首次截获。2013年，宁波局在进口日本罗汉松植株上，采用DNA条形码技术截获可可花瘿病菌（Nectria rigidiuscula），经中国检科院专家确认这是我国首次截获该病菌。