小芯片让五种植物病毒快速“现形”

　　汪万春，北京检验检疫局检验检疫技术中心副主任，高级农艺师。近年来，组织和参与了地中海实蝇、苹果蠹蛾、咖啡果小蠹、辣椒实蝇、橘小实蝇、芒果果核象甲、芒果果实象甲、纳塔尔实蝇、美国白蛾等重要检疫性有害生物的截获和鉴定，具有丰富的口岸工作经验。共主持和参加了科研课题18项，在国内外学术期刊上公开发表论文11篇，其中第一作者3篇，6篇获北京检验检疫局优秀科技论文奖。1997年被评为“全国口岸植物检疫优秀工作者”；2001年1月被授予“全国出入境检验检疫系统先进工作者”称号；于2001年6月被授予“全国质量监督检验检疫系统优秀共产党员”称号。

　　科技攻关

　　2010年12月21日，在北京检验检疫局承担的国家质检总局科技计划项目《植物病毒蛋白芯片检测技术研究》专家验收会上，项目组研发的可同时检测香石竹斑驳病毒、黄瓜绿斑驳病毒、烟草脆裂病毒、百合无症病毒和番茄斑萎病毒五种检疫性植物病毒的五联卡硝酸纤维素膜单抗检测蛋白芯片，在15分钟内即可读全部检测结果，相较于传统检测一个病毒的十几个小时，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。此科研成果引起了专家高度重视。

　　资料显示，植物感染病毒后，对植物细胞的影响与动物病毒一样，会打乱植物细胞的正常代谢活动，使植物的生长和发育遭到破坏，从而降低农作物的产量和品质。番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒、黄瓜绿斑驳病毒、香石竹斑驳病毒、百合无症病毒都能造成蔬菜、花卉等重要经济作物的损失，其中番茄斑萎病毒、黄瓜绿斑驳病毒是重要外来检疫对象，其余3种病毒由于其危害重大，在国内和各省区之间也列为重要防疫对象。据统计，每年由于病毒病的危害，全世界的粮食损失达200亿美元。病毒通常造成退绿、矮化、畸形等症状。由于病毒是专性寄生物，至今仍缺乏具有选择性的高效治疗药剂，使病毒病日益严重，成为当前农业生产中的一类重要病害。所以，在口岸检测中起阻断、隔离的植物检疫就是最好的防治手段。

　　北京检验检疫局《植物病毒蛋白芯片检测技术研究》项目组研究制备了上述5种病毒的单克隆抗体细胞株的单克隆抗体和多克隆抗体，并拥有了自主知识产权。该项目组负责人北京检验检疫局检验检疫技术中心副主任汪万春介绍，为方便使用，项目组同时研发了五联卡硝酸纤维素膜单抗检测蛋白芯片。相较于同类研究采用玻璃等基质制备芯片，硝酸纤维素膜基质的使用降低了制备工艺难度和应用对设备的依赖性；用硝酸纤维素膜为材料的蛋白芯片的基质；用金颗粒标记抗体；玻璃纤维素膜制备金标垫；检测灵敏多克隆抗体作为标记抗体，单克隆抗体作为检测抗体组装芯片，相较于只用多克隆抗体作为检测抗体，显著地提高了检测特异性；五种病毒同时检测，检测结果15分钟内可读，相较于传统检测一个病毒的十几个小时，缩短了检测时间，大大提高了检测效率。

　　验收会上，专家们审查了项目组提交的相关资料，听取了项目组的工作报告和技术报告，并进行了质询。参会专家对项目组的研究工作给予了充分的肯定。专家们一致认为：该项目试验设计合理，方法科学，数据翔实，资料齐全，结果可靠，完成了计划任务书规定的研究内容，达到国际先进水平，一致同意项目通过鉴定，并建议尽快推广应用。

　　汪万春还介绍说，该项目组根据研究成果申请了两项国家发明专利；在《INDIAN JOURNAL OF VIROLOGY》发表SCI研究论文1篇；制定了《番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒、黄瓜绿斑驳病毒、香石竹斑驳病毒、百合无症病毒快速筛选检测蛋白芯片法》行业标准1项，目前正在系统内征求意见。

　　目前，检测植物病毒的方法主要采用进口抗血清检测试剂盒进行酶联免疫吸附测定（ELISA）以及用电镜直接观察组织中的病毒粒子。从已有报道看，目前国内外对血清学检测方法均基于多抗血清而建立的，商品ELISA检测试剂盒也多是多抗血清，然而多克隆抗体存在非特异性高、准确性和均质性差、产量有限等不足，难以满足日益增长检测需求；电镜检测需要昂贵的设备而不能普及应用。因而迫切需要建立快速、准确、简便的检测方法，为病毒病的诊断提供技术支持。为此，本项目利用五种病毒的抗原免疫小鼠和大白兔，制备了五种病毒的单、多克隆抗体，开展了检测五种病毒的技术研究，开发了蛋白芯片，为五种病毒的田间检测及进出口检疫提供技术支撑和快速的检测方法和产品。

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　　番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是布尼亚病毒科(Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的典型成员，也是寄主范围最广、最具经济重要性的病毒之一。TSWV在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋洲等多个国家和地区广泛分布，温带、亚热带和热带地区均有发生，能侵染包括烟草、大豆、番茄、花生、辣椒、莴苣、菊花、凤仙花等80 科900 多种植物，且发现的寄主种类还在不断增加。

　　烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）通过生于土壤的线虫（Trchodorus and Paratrichodours）传播。线虫往往会在排水不良的地方发现，在这种地方TRV持续存在，并通过当地的线虫传播到敏感植物种类上。许多种类的杂草是病毒主要的所在地，马铃薯以及其他一些农作物是次要场所。TRV分布广泛，可以侵染大量的植物种类，在马铃薯、烟草、观赏植物的块茎上会引起重要的经济损失。该病毒目前是我国的检疫生物之一。

　　黄瓜绿斑驳病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）是在欧洲，印度，韩国和日本葫芦科植物上发现的一种RNA病毒，以种传和接触性传播为主要途径。病毒易通过汁液传播，但病毒的寄主范围较窄，主要侵染葫芦科植物，引起典型的斑驳和花叶症状，在成熟期可以导致西瓜果实内部果肉严重变色腐烂或者纤维化，黄瓜果实大部分黄化变白并产生黑绿色水疱状坏死斑，失去实用和商业价值，产量损失可达15%以上。

　　香石竹斑驳病毒（Carnation mottle varus, CarMV）广泛发生于世界香石竹栽培地区，引起香石竹品种退化，长势衰弱，植株畸形，花叶，花枝变小，花碎色，叶茎和花出现枯斑，因而使产量和品质下降，降低了观赏价值和经济价值。感染香石竹的病毒有10余种,其中香石竹斑驳病毒是最主要的病毒之一。CarMV靠汁液摩擦传播，能侵染香石竹、中国石竹、甜石竹、苋色黎、菠菜、千日红等多种植物。

　　百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV）是麝香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）成员，病毒粒子为略弯曲的线状，无包膜，长610nm～700nm，直径12nm～15nm，螺旋对称结构。病毒基因组为单分子线形正义ssRNA，长8394nt，含有6个ORF。LSV主要侵染百合科植物，单独侵染百合寄主时表现为隐症，与其他病毒复合侵染时则可引起严重的田间症状，直接影响了百合的花和球茎质量，给花卉生产带来重大经济损失。

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　　九个微生物监控模型应用效果好

　　2010年12月22日，在北京检验检疫局承担的国家质检总局科技计划项目《出口食品微生物监控模型的建立》专家验收会上，根据该项目组人员展示的肉鸡、生猪、水产品的九个微生物监控模型及此监控模型在肉鸡屠宰加工企业所进行的3年的应用试验，和大量连续性的数据显示，此成果具有重要的社会效益和实用价值。专家一致认为：该项目立题明确，研究方法和技术路线科学合理，超额完成了计划任务书的研究内容，总体达到国内领先水平，项目通过鉴定，并建议成果尽快推广应用。

　　《出口食品微生物监控模型的建立》项目组研究和比较了国际食品中微生物过程控制相关法规和技术路线，在国内首次系统地开展肉类食品和水产品微生物过程监控的比较和研究，并建立了肉鸡、生猪、水产品的九个微生物监控模型。利用建立的微生物过程控制模型，在肉鸡屠宰加工企业进行了3年的应用试验，积累了大量连续性的数据，为建立我国肉鸡屠宰过程的微生物过程控制标准提供了科学依据。同时利用该模型对三文鱼污染状况进行了监测，掌握了三文鱼的微生物污染状态。

　　项目组在国内率先进行了加工过程的微生物监控研究，为制定我国的微生物过程控制标准提供科学依据。根据测试单位出具的验证报告来看，所建立的微生物监控模型设计合理，可操作性强，有利于加强肉鸡生产企业的微生物监控管理，促进产品安全质量的提高，具有显著的社会效益和实用价值。

　　验收会上，来自质检系统、卫生、农业的专家组成的鉴定委员会仔细审阅了课题组提交的材料，认真听取了研究报告和工作报告，对项目组的研究工作给予了充分的肯定。